和帝永元二年(公元90年),超又定月氏。先是月氏以助汉有功，因求汉公主，为超所拒绝，因怀怨恨。是年派其副王领兵七万攻超。超的部众自以人数单少，大为忧恐。超晓谕军士道：“月氏兵虽多，但越过葱岭，经数千里而来，并无运输接济，何须忧惧呢?我们只要把粮食收藏起来，据城坚守。他们饥饿疲困，自会投降，不过几十天便了结。”月氏攻超不下，钞掠又无所得，超预料他们粮食将尽，必向龟兹求援。于是伏兵数百，在东界等候。果然遇到月氏派去龟兹的人马，带着无数的金银珠玉，伏兵把他们解决了。班超把使人的首级送给月氏副王。他看了大惊，派人请罪并求放他生还。班超答应了他。月氏由此慑服，每年纳贡。永元三年，即耿夔灭北匈奴的一年，龟兹、姑墨、温宿皆向班超投降。朝廷拜超为西域都护，超设都护府于龟兹，废其王，拘送京师，而另立新王。是时西域五十多国，除焉耆、危须、尉犁因从前曾攻杀都护，怀着贰心外，其余尽皆归附汉朝。其后永元六年，这三国亦为班超所平定。